細胞凋亡實驗：
人體內(nèi)的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，到目前為此，人們已經(jīng)知道細胞的死亡起碼有兩種方式，即細胞壞死與細胞凋亡（apoptosis）。 細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著的作用。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。

細胞凋亡與壞死的區(qū)別：
壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞 脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。
凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

形態(tài)學變化：
形態(tài)學觀察細胞凋亡實驗的變化是多階段的，往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。先出現(xiàn)的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。
a，形態(tài)學
原理：一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與　DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
優(yōu)點：簡單、方便，成本低
缺點：很主觀，非常依賴實驗者的經(jīng)驗
b，DNA含量

原理：細胞凋亡時,核酸內(nèi)切酶激活,導致DNA 斷裂,這是凋亡的特征性表現(xiàn),也為FCM 鑒別凋亡細胞奠定了基礎。當細胞用乙醇、TrtionX—100 處理后細胞膜上出現(xiàn)漏洞，小片段DNA 從細胞內(nèi)釋放出來,使其DNA 含量低于正常細胞的二倍體。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍體G1峰前出現(xiàn)“亞二倍體"峰，即細胞凋亡峰(APO峰) ,根據(jù)APO峰可測出凋亡細胞百分率。
優(yōu)點：該法簡單易行,可大批定量檢測凋亡標本,亦可同時分析細胞的細胞周期位置。
缺點：DNA 含量測定在檢測細胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因為APO 峰代表了一組細胞群體，包括凋亡細胞、機械損傷細胞、低DNA 含量的細胞或不同染色體結構的細胞，在上述情況下,DNA 與熒光染料的結合量均小。另外，非固定的細胞在低滲溶液中被溶解時，可導致大量的核碎片出現(xiàn)，此時APO 峰的細胞數(shù)目只代表了核碎片的數(shù)目，并不代表凋亡細胞數(shù)目。敏感性較差的原因是細胞凋亡早期只有DNA 斷裂點出現(xiàn)，但尚未出現(xiàn)DNA 片段的大量丟失，所以該法不能檢出早期凋亡細胞和發(fā)生于S 期或G2/ M 期的凋亡細胞，因為其實際含量不低于二倍體細胞所含的DNA，因此該法進行凋亡細胞分析時應結合其它形態(tài)或生化方法，以期更準確地分析細胞的凋亡狀態(tài)。
c，AnnexinV/PI

原理：PS從細胞膜內(nèi)側轉(zhuǎn)移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發(fā)展階段。
優(yōu)點：細胞凋亡時膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏，且該法不需要固定細胞，避免了PI 法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA 片段丟失，因此更加省時，結果亦更可靠，是目前為理想的凋亡定量檢測方法。
缺點：檢測早期凋亡更好，好與其他檢測晚期凋亡的方法結合使用，對檢測試劑、儀器要求較高。
d，線粒體膜電位
原理：在受到凋亡誘導后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。

優(yōu)點：采用熒光的檢測方法，放大了凋亡信號，靈敏度高。
缺點：不能區(qū)分細胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。

e，TUNEL

原理：由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活,細胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，并產(chǎn)生與DNA 斷點數(shù)目相同的3’ 羥基末端，TdT 可以將生物素化的dUTP 標記至3’ 羥基末端，通過卵白素2FITC 系統(tǒng)，使DNA 的斷點部位發(fā)生特異熒光而簽別出凋亡細胞。但由于斷裂DNA 的標記過程比較復雜，涉及多種因素，所以末端標記的陰性結果并不代表DNA鏈的完整，應排除方法上的問題，如TdT 酶活力的喪失等諸多影響因素。因此應用TdT 末端標記法鑒別凋亡細胞同時設陽性及陰性對照組，以便得到可靠結果。
優(yōu)點：TdT末端標記法是鑒別凋亡細胞比較特異的一種方法
缺點：標記過程比較復雜，涉及多種因素，實驗成敗受試劑質(zhì)量、操作手法影響較大。

f，Caspase-3/7
原理：Caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶，Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成。Caspase-3主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，該酶與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關。在細胞凋亡啟動時，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31kD和85kD兩個片段，使PARP中與DNA結合的兩個鋅指結構與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結果使受PARP負調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡?？梢酝ㄟ^Western blot，酶活性檢測，流式細胞術等技術檢測Caspase 3/7的活性與表達。
優(yōu)點：Caspase 3/7活性檢測，可檢測的方法學較廣，靈敏度較高。
缺點：需要和下游PARP的檢測，同時驗證。

g，PARP

原理：PARP，即poly(ADP-ribose) polymerase，是定位在細胞核內(nèi)，和應激條件下DNA修復密切相關的一種酶。PARP在體外可以被多種Caspase剪切，在體內(nèi)是Caspase 3的主要剪切對象。對于人PARP，在Asp124和Gly215之間被Caspase剪切后，使PARP羧基端的催化結構域(89kD)和氨基端的DNA結合結構域(24kD)相分離，從而使PARP失去其酶活力。PARP對于細胞的穩(wěn)定和存活非常重要，PARP失去酶活力會加速細胞的不穩(wěn)定。PARP剪切被認為是細胞凋亡的一個重要指標，也通常被認為是Caspase 3激活的指標。
優(yōu)點：檢測方法常規(guī)可信，凋亡特異性高
缺點：不能檢測凋亡早期

服務說明：
1. 凋亡檢測方法可由客戶，也可由我們推薦，后由客戶抉擇；
2. 凋亡實驗涉及的細胞、藥物，可由客戶提供，也可查看公司的產(chǎn)品庫，亦可由我們代購；
3. 凋亡實驗建議選擇2種不同的方法相互驗證。
提交的產(chǎn)品和資料：
實驗報告

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